豬瘟病毒(CSFV)熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱:豬瘟病毒(CSFV)核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)
Name :Diagnostic Kit for Classical Swine Fever Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規(guī)格】48 份/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的扁桃體、淋巴結等組織病變部與健康部交界處組織、全
血等標本中豬瘟病毒 RNA,適用于豬瘟病毒感染的輔助診斷。其檢測結果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對豬瘟病毒特異性引物,結合一條特異性熒光探針,用一步法熒
光 RT-PCR 技術對豬瘟病毒 RNA 進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的
病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μl×1 管
CSFV 反應液 1.0ml×1 管
CSFV 陽性質控品 50μl ×1 管
陰性質控品 250μl ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次,
有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺的豬,取扁桃體、淋巴結等組織病變部與健康部交界處組織;待檢活
豬,用注射器取血 5mL。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標
本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取 0.05g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管中;全血樣品待血凝后取血清 100uL,置 1.5mL 離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取法),請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性
對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑 CSFV 反應液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μl,分別加入相應的反
應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25ul;熒光通道選擇:
檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數設置:
步驟 循環(huán)數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲
線出現(xiàn)整體傾斜時,根據分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié)),以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數增長曲線;
可疑:檢測通道 35.0<Ct 值≤37,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35.0<Ct
值≤37,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結果 Ct 值>37 或無 Ct 值。
7. 質控標準
陰性質控品:無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且 Ct 值≤32;
以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
8. 產品性能指標
陰陽性參考品符合率:5 份陽性參考品符合率為 100%;10 份陰性參考品符合率
為 100%。
低檢測限:5.0×102copies/ml。
精密度:批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(CV)均小于等于 3%。
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【注意事項】
Ø 所有操作嚴格按照說明書進行;
Ø 試劑盒內各種組分使用前應自然融化,*混勻并短暫離心;
Ø 反應液應避光保存;
Ø 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服;
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;
Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全
通則》進行處理。
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