雞傳染性支氣管炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

使用說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名：雞傳染性支氣管炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Infectious Bronchitis Virus (ELISA)

【包裝規(guī)格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒

【預(yù)期用途】 雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起雞的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道傳染病，本病呈世界性分布，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一。疫苗免疫是預(yù)防和控制雞傳染性支氣管炎發(fā)生的有效途徑，而免疫后抗體水平的高低反映實(shí)際的疫苗免疫效果，直接關(guān)系到免疫雞群對(duì)禽流感病毒的抵抗力。

    雞傳染性支氣管炎抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫)適用于：雞血清抗體的檢測(cè)，以確定被檢雞是否感染過雞傳染性支氣管炎病毒或免疫雞體內(nèi)抗體水平；評(píng)估雞群感染IBV的風(fēng)險(xiǎn)程度；了解雛雞母源抗體水平，為IBV免疫程序的制定提供參考。

【原    理】

    雞傳染性支氣管炎抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫)由預(yù)包被雞傳染性支氣管炎病毒重組N蛋白的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測(cè)雞血清或血漿中雞傳染性支氣管炎病毒抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在酶標(biāo)板中加入對(duì)照血清和稀釋的待檢血清，經(jīng)溫育后，若樣品中含有雞傳染性支氣管炎病毒的抗體，則將與酶標(biāo)板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入酶標(biāo)記物，與酶標(biāo)板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，在孔中加TMB底物液，與酶標(biāo)結(jié)合物反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標(biāo)儀在450nm波長測(cè)定各反應(yīng)孔中的吸光值，即可知樣品是否含有傳染性支氣管炎病毒抗體。

【試劑盒組成】

【儲(chǔ)存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個(gè)月。

包被板開封后請(qǐng)于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個(gè)月。

【適用儀器】 含450nm、630nm波長的酶標(biāo)儀，37℃恒溫設(shè)備，可調(diào)微量移液器。

【樣品準(zhǔn)備】

1.取動(dòng)物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。

2.用樣品稀釋液將待檢血清先按10倍稀釋（如在稀釋板中加入90μl樣品稀釋液再加10μl血清，混勻）。陰、陽性對(duì)照不用稀釋。

3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。

【檢驗(yàn)方法】

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。

2.取所需用量酶標(biāo)板條，設(shè)空白對(duì)照1孔、陰性/陽性對(duì)照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.空白對(duì)照孔加樣品稀釋液100μl；陰、陽性對(duì)照孔分別加入陰、陽性對(duì)照100μl；樣品孔每孔加入樣品稀釋液90μl，再加入稀釋后的血清10μl。

注：樣本稀釋比例相當(dāng)于1:100。

4.混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加350 ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，后一次拍干。

6.每孔加酶標(biāo)記物100μl（空白孔除外）。蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)10分鐘。

9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測(cè)定各孔吸光值（A值），無參比波長用空白孔調(diào)零(即所有孔吸光值減去空白孔吸光值)。

【參考值】 實(shí)驗(yàn)正常的情況下，陰性對(duì)照≤0.10，陽性對(duì)照≥0.6。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1.C.O（臨界值）=0.13+陰性對(duì)照孔均值（陰性對(duì)照孔均值低于0.07時(shí)以0.07計(jì)算）。

2.未曾免疫雞群：樣品A值≥C.O為陽性；樣品A值＜C.O為陰性。

3.免疫雞群：監(jiān)測(cè)并記錄樣本當(dāng)時(shí)的抗體水平，根據(jù)結(jié)果分析抗體水平的分布及雞群免疫狀態(tài)的動(dòng)向。

【試驗(yàn)方法的局限性】

    該試驗(yàn)僅作為定性檢測(cè)雞血清或血漿中雞傳染性支氣管炎病毒IgG抗體，根據(jù)A值高低可作抗體水平強(qiáng)、中、弱的粗略評(píng)估。

【注意事項(xiàng)】

1.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需戴手套、穿工作衣，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實(shí)驗(yàn)廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

2.終止液具有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請(qǐng)立即用大量自來水沖洗。

3.酶標(biāo)板從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開袋，未用完的酶標(biāo)板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時(shí)容易結(jié)晶，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫以*溶解。

5.洗滌時(shí)各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測(cè)的樣品應(yīng)保持新鮮。

7.試驗(yàn)結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

8.不同批號(hào)試劑組分不得混用。